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研域干貨：培養(yǎng)細(xì)胞樣品怎么處理？
發(fā)布時(shí)間： 2019-11-14 點(diǎn)擊次數(shù)： 2077次樣本處理的方法：
1. 融解RIPA裂解液，混勻。取恰當(dāng)量的裂解液，在運(yùn)用前數(shù)分鐘內(nèi)參加PMSF，使PMSF的終濃度為1mM。
2. 關(guān)于貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍(假如血清中的蛋白沒有干擾，能夠不洗)。依照6孔板每孔參加150-250微升裂解液的份額參加裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充沛觸摸。一般裂解液觸摸細(xì)胞1-2秒后，細(xì)胞就會(huì)被裂解。3. 充沛裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
關(guān)于安排樣品：
1. 把安排剪切成細(xì)微的碎片。
2. 融解RIPA裂解液，混勻。取恰當(dāng)量的裂解液，在運(yùn)用前數(shù)分鐘內(nèi)參加PMSF，使PMSF的*終濃度為1mM。
3. 依照每20毫克安排參加150-250微升裂解液的份額參加裂解液。(假如裂解不充沛能夠恰當(dāng)添加更多的裂解液，假如需求高濃度的蛋白樣品，能夠恰當(dāng)減少裂解液的用量。)
4. 用玻璃勻漿器勻漿，直至充沛裂解。5. 充沛裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
6. 假如安排樣品自身非常細(xì)微，能夠恰當(dāng)剪切后直接參加裂解液裂解，經(jīng)過強(qiáng)烈vortex使樣品裂解充沛。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)試驗(yàn)。直接裂解的長(zhǎng)處是比較方便，不用運(yùn)用勻漿器，缺陷是不如運(yùn)用勻漿器那樣裂解得比較充沛。