真菌毒素檢測技術與產品服務（4）

發布時間： 2009/3/27　　點擊次數： 2910次

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液相色譜法對飼料中赭曲霉毒素的測定

摘要：研究了液相色譜法測定飼料原料和配合飼料中赭曲霉毒素的方法。樣品經已腈水（84：16）提取，提取液通過赭曲霉毒素凈化柱凈化、濃縮，C18色譜柱分離，熒光檢測器檢測，外標法定量。對添加兩個濃度赭曲霉毒素的玉米樣品進行添加回收實驗，平均回收率為99.12%和103.09%，變異系數RSD分別為0.281%、1.214%，zui低檢測限為0.20ng/kg，方法簡便易行，準確精密度高，值得推廣。

Abstract: HPLC is applied to the determination of ochratoxin A in feed .The sample is extracted with 84/16 acetonitrile/water. Filtrace is cleaned up by ochratoxin purification column. Fluorescent ochratoxin A is separated on NovapakC18 column,and is detected by fluorescent detector and is quantified by external standard. Corn samples are fortified with ochratoxin A at the twe levels. Five replicate analysis are performed each level. The recoveries of ochratoxin A are 99.30%~103.09%.The variation coefficients are 0.281%~1.214%.The detection limit is 0.20ng/kg. The precision and accuracy of this method are satisfactory.

Keywords: HPLC； pretreatment ； ochratoxin A

霉菌遍布世界各地，種類繁多，依生活習性，分為倉儲霉菌和田間霉菌，前者指儲存原料和飼料在適宜的溫度、濕度下產生的霉菌，zui適宜溫度為25-30℃，相對濕度80-90%。赭曲霉毒素是溫暖地區zui重要的倉儲毒素，廣泛存在于玉米、大麥、小麥和飼料中,麩皮的污染高于整粒谷物。廣東地處亞熱帶，溫濕度十分適宜霉菌的生長，據有關調查該毒素污染在原料和配合飼料中普遍存在，陽性率大于60%²。赭曲霉毒素危害很大，致癌性*。據報道，每千克飼料中含有0.2-0.3克，就可使雞中毒，zui常見的臨床表現有：鈣磷吸收障礙，骨骼脆弱，蛋殼鈣化不全，破蛋率高，皮下出血，容易挫傷。對家畜主要攻擊腎臟、免疫系統和造血系統，肝臟變得脆弱，劇渴，生長遲緩，多尿、下痢、糖尿癥。根據中國國家有關規定，赭曲霉毒素的zui高*為：20ug/kg.

現常用的檢測方法多為薄層色譜和酶聯免疫法，薄層色譜法操作繁瑣，污染大、定量差，耗時長，而酶聯免疫法雖操作簡單，但存在假陽性，準確性欠佳，此液相色譜法操作簡便，快速，準確靈敏度高，不失為一種好方法。

1.實驗部分：

1.1試劑和儀器

已腈（色譜純）冰醋酸（分析純）去離子水

赭曲霉標準液 PuriTox^SR 130赭曲霉毒素凈化柱液相色譜儀熒光檢測器

1.2步驟

1.2.1 取樣：取代表樣品5kg，粉碎，充分混合均勻，四分法縮至500g, 因霉菌毒素分布不均勻，充分混合非常重要，必要時取樣量加大，有地方建議取15kg。

1.2.2 提取：取25g粉碎樣品于250ml三角燒瓶內，加100ml已腈水（84：16），在振蕩器上振蕩1小時，用定量濾紙過濾。

1.2.3 標準準備：將50ul 10ug/ml 的赭曲霉毒素在一個棕色瓶子里吹干，用10ml的流動相進行溶解，渦旋1分鐘，此為50ng/ml的赭曲霉毒素標準液；另將1 ml10ug/ml

的赭曲霉毒素在一棕色瓶子內吹干，用10ml的流動相溶解，渦旋1分鐘，此為1ug/ml的赭曲霉加標標準溶液。

1.2.4 凈化濃縮：取7ml的樣品提取液用PuriTox^SR 130赭曲霉毒素凈化柱，然后將凈化液轉移4ml的凈化液到另一試管，60℃水浴中氮氣吹干，用400ul的流動相（60/40/1水/已腈/已酸）溶解，渦旋30min ，轉移到1.5ml的離心管內10000轉離心5分鐘，轉移350ul 的清潔樣品進入液相。

1. 3儀器條件

Waters2695液相色譜儀，2475熒光檢測器

色譜柱：NovapakC18（5um） 3.90*150mm Waters PAHC18（5um）4.6*150mm

流動相：60/40 水/已腈

流速：0.5ml/min 運行時間：20min

柱溫：40℃

進樣體積：60ul

EX:330nm EM:460nm

2.0測定結果

2.1 標準曲線及回歸方程：取制定好的50ng/ml的標準溶液，用流動相分別稀釋成1、2、5、10、20、30、50ng/ml的濃度，上液相色譜進行檢測，根據檢測的峰面積對應相應濃度制成標準曲線。相關系數為0.9995，回歸方程是Y=1.11×10⁵X-1.85×10³,檢測限：0.20ng/kg.

表1. 標準曲線的基本參數：

Tab.1 Regression equation

濃度范圍 Concn.Range（ng/ml）	1.0	2.0	5.0	10.0	20.0	30.0	50.0
峰面積 Peak area	103454.993	210799.985	515389.964	1064099.926	2285364.840	3442139..760	5463738.891
相關系數 Correlation	0.9995
回歸方程 Regression equation	Y=1.11×10⁵X-1.85×10³
檢測限 Limit of detection	0.20ng/kg（按3倍信噪比計算）

2.2不同濃度添加回收實驗：取玉米樣品1份，分別做兩個濃度的添加回收實驗，結果見表2。

表2.兩個濃度的樣品添加回收實驗結果表：

Tab.2 Recovery test

組分 Ingtedient	本底值 Known value （ng/ml）	添加標準液的體積	10ul					35ul
赭曲霉毒素	0	添加處理后理論濃度 Added	14.28ng/ml					50.0ng/ml
		添加次數	1	2	3	4	5	1	2	3	4	5
		添加后測得濃度（ng/ml） Found	14.18	14.16	14.13	14.20	14.10	52.06	52.16	51.13	51.68	50.69
		回收率 Recovery （%）	99.30	99.16	98.95	99.44	98.74	104.12	104.32	102.26	103.36	101.38
		平均值 Average value	99.12					103.09
		RSD（%）	0.281					1.214

2.3精密度實驗：選擇不同含量的玉米樣品兩份，分別平行測定8次，結果見表3

表3.精密度實驗結果

Tab.3 Precision test

檢測次數	1	2	3	4	5	6	7	8	平均值	RSD
樣品1測定值 Sample 1 Found（ng/ml）	11.23	11.46	11.41	11.36	11.87	11.97	11.67	11.75	11.59	2.27
樣品2測定值 Sample 2 Found（ng/ml）	28.57	28.62	28.68	28.98	28.87	28.12	28.92	28.53	28.66	0.963

3.0結論：

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